发明名称：基于SARS-CoV-2假病毒的中和抗体检测方法
摘要
本发明涉及一种基于SARS‑CoV‑2假病毒的中和抗体检测方法。本发明还涉及一种重组载体，一种类病毒颗粒，以及一种细胞株。本发明还涉及检测SARS‑CoV‑2类病毒感染力的方法以及检测SARS‑CoV‑2抗体中和活性的方法。本申请的所构建的细胞株能够稳定、高效的应用于假病毒感染力检测以及抗体中和活性检测中，且降低了检测成本。
权利要求
1.一种重组载体，其含有编码ACE2蛋白和Furin蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述ACE2蛋白和Furin蛋白为天然的哺乳动物(例如，人)的ACE2蛋白和Furin蛋白；
更优选地，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；更优选地，所述Furin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述重组载体为表达载体；
更优选地，所述重组载体由质粒构建；进一步优选地，所述质粒选自pLV，pcDNA3.1+、pCAG3.1和pCMV3.1；
优选地，所述重组载体还包含编码Furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ACE2蛋白信号肽的核苷酸序列；
更优选地，所述Furin蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；更优选地，所述ACE2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有ACE2蛋白和Furin蛋白；
优选地，所述类病毒颗粒由权利要求1所述的重组载体与核酸组分共转染哺乳动物细胞而包装得到；
优选地，所述核酸组分选自下述的任意一项或多项：
(a)外源DNA，或者编码外源蛋白或多肽的外源DNA，或者编码RNA的外源DNA；
(b)一种载体，其任选地包含(a)中所述的外源DNA；
(c)外源RNA，或者编码外源蛋白或多肽的外源RNA；
(d)一种载体，其任选地包含(c)中所述的外源RNA；
优选地，所述核酸组分为包装质粒。
3.一种细胞株，所述细胞表达或过表达ACE2蛋白和Furin蛋白；
优选地，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；更优选地，所述细胞为293T细胞；
优选地，所述细胞株的基因组中整合有编码ACE2蛋白和Furin蛋白的核苷酸序列；
优选地，所述ACE2蛋白和Furin蛋白为天然人ACE2蛋白和天然人Furin蛋白；
更优选地，所述ACE2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；更优选地，所述Furin蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
优选地，所述细胞株的基因组中还整合有编码Furin蛋白信号肽的核苷酸序列和/或编码ACE2蛋白信号肽的核苷酸序列；
更优选地，所述Furin蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；更优选地，所述ACE2蛋白信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
优选地，所述细胞株的保藏号编号为CCTCC No:C202189。
4.一种制备权利要求3所述的细胞株的方法，所述方法包括：
(1)将编码ACE2蛋白的第一核酸组分和编码Furin蛋白的第二核酸组分共转染哺乳动物细胞；任选地，将第三核酸组分与所述第一核酸组分和第二核酸组分共转染哺乳动物细胞，获得类病毒颗粒；
(2)将所述类病毒颗粒转染哺乳动物细胞；
(3)筛选步骤(2)获得的细胞，获得的阳性细胞即为所述细胞株；
优选地，在步骤(1)中，所述第三核酸组分含有类病毒颗粒所需的一个或多个基因或元件；优选地，所述一个或多个基因或元件包含gag基因、env基因和/或pol基因；
优选地，在步骤(3)中，通过抗生素或荧光标记筛选所述培养获得的细胞；更优选地，所述抗生素为潮霉素或杀稻瘟菌素；
优选地，所述第一核酸组分和第二核酸组分包含于相同的载体或不同的载体中；
优选地，所述第一核酸组分、第二核酸组分和第三核酸组分包含于相同的载体或不同的载体中。
5.一种检测SARS-CoV-2类病毒感染力的方法，所述方法包括，将权利要求3所述的细胞株与SARS-CoV-2类病毒接触，并测试病毒滴度；
优选地，所述方法包括，将权利要求3所述的细胞株与SARS-CoV-2类病毒接触并孵育，加入荧光检测试剂，检测荧光值并计算类病毒滴度。
6.一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将SARS-CoV-2类病毒颗粒与权利要求3的细胞株接触之前、同时或之后，将所述SARS-CoV-2类病毒颗粒或细胞株与所述抗体接触。
7.一种试剂盒，其包括一种或多种选自下列的组分：权利要求1所述的重组载体，权利要求2所述的类病毒颗粒，权利要求3所述的细胞株；
任选地，其还包含选自下述中的一项或多项：
(1)编码权利要求1所述的重组载体的第一核酸分子；
(2)含有类病毒颗粒所需的基因或元件的一个或多个辅助核酸分子；优选地，所述一个或多个辅助核酸分子包含gag基因、env基因和/或pol基因；
优选地，所述试剂盒还包含用于将核酸分子转移入宿主细胞中的试剂，和/或，用于插入核酸分子的载体；优选地，所述宿主细胞为哺乳动物(例如，人)的细胞；优选地，所述宿主细胞为293T细胞；任选地，所述试剂盒还包含宿主细胞；
优选地，所述一个或多个辅助核酸分子包含于相同的载体或不同的载体中；
优选地，所述一个或多个辅助核酸分子与所述第一核酸分子包含于相同的载体或不同的载体中；
优选地，所述试剂盒还包括SARS-CoV-2类病毒和/或转染试剂；
优选地，所述转染试剂选自：lipofectamine2000、lipofectamine3000、PEI，或其任何组合；
优选地，所述SARS-CoV-2类病毒与所述细胞株的选用量分别为小于1200TCID50的类病毒和小于5*104/well的细胞株；更优选地，所述SARS-CoV-2类病毒与所述细胞株的选用量分别为300TCID50的类病毒和1*104/well的细胞株；
优选地，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2类病毒的感染力；
优选地，所述试剂盒用于检测SARS-CoV-2抗体的中和活性。
8.一种筛选能够抑制SARS-CoV-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将SARS-CoV-2类病毒颗粒与权利要求3的细胞株接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或细胞株与所述候选药物接触。
9.权利要求1所述的重组载体、权利要求2所述的类病毒颗粒、权利要求3所述的细胞株、权利要求7所述的试剂盒用于检测SARS-CoV-2类病毒的感染力或者用于检测SARS-CoV-2抗体的中和活性的用途。
10.制备权利要求2的类病毒颗粒的方法，其包括：
(a)用下述物质转染宿主细胞：
(1)编码权利要求1的重组载体的第一核酸分子；
(2)含有形成类病毒颗粒(例如HIV病毒样颗粒或SIV病毒样颗粒)所需的基因或元件的一个或多个辅助核酸分子；优选地，所述一个或多个辅助核酸分子包含gag基因、pol基因和/或env基因；和
(b)在允许蛋白表达的条件下培养所述宿主细胞，以产生类病毒颗粒；
优选地，所述细胞为哺乳动物(例如，人)的细胞；优选地，所述细胞为293T细胞。
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