发明名称：调节戊型肝炎病毒组装和衣壳蛋白ORF2稳定性的方法
摘要
本发明涉及通过HDAC6抑制剂改善戊型肝炎病毒生产、HEV病毒复制、病毒ORF2蛋白稳定性、和HEV病毒样颗粒形成的方法。本发明还涉及用于戊型肝炎病毒、病毒样颗粒和ORF2蛋白生产的细胞培养系统、和细胞培养物。此外，本发明也涉及通过增加细胞中HDAC6的表达和/或活性，治疗HEV病毒感染的方法。
权利要求
1.一种改善HEV病毒生产的方法，包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养HEV感染的细胞，
其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，
其中所述HEV病毒是基因型1-4的HEV病毒。
2.一种改善HEV病毒样颗粒生产的方法，包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养包含表达 ORF2多肽的重组表达构建体的细胞，
其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，
其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：
(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；
(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN且包含全长ORF2序列的 aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；
(c)(a)或(b)的同源物或变体。
3.一种改善HEV ORF2多肽生产的方法，包括：在HDAC6抑制剂存在下，培养包含编码HEV ORF2多肽的核酸的细胞，
其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，
其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：
(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；
(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN且包含全长ORF2序列的 aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；
(c)(a)或(b)的同源物或变体。
4.权利要求1-3的方法，其中敲低细胞中HDAC6的表达水平，优选地使用抑制HDAC6表达 的核酸分子，尤其是siRNA或shRNA或其表达构建体来实现HDAC6水平的敲低；优选地，在病 毒感染或ORF2表达之前敲低HDAC6表达。
5.权利要求1-4的方法，其中所述细胞是HDAC6敲低细胞，优选地细胞是HDAC6组成型敲 低细胞或HDAC6条件性敲低细胞。
6.权利要求1-3的方法，其中使用HDAC6化学抑制剂处理细胞以降低细胞中HDAC6活性，
其中HDAC6化学抑制剂选自：非选择性抑制剂如TSA、Vorinostat,LBH589,ITF2357, PXD-101，或HDAC6选择性抑制剂如rocilinostat(ACY-1215)，ACY-241，Tubacin， Tubastatin A(TBSA)，CAY10603，Nexturastat A，HPOB，ACY-738，ACY-775,和ACY-1083，或 其任意组合。
7.权利要求6的方法，其中使用选自以下的HDAC6抑制剂处理细胞：
(a)浓度0.2μM-5μM，优选1μM的Trichostatin A(TSA)，
(b)浓度1μM-10μM，优选6μM的Tubastatin A(TBSA)，
(c)浓度0.1μM-1μM，优选0.2μM的CAY10603。
8.权利要求1-7的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中HEV ORF2蛋 白的K411乙酰化水平增加。
9.权利要求1-8的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中ORF2的稳定 性增加和/或细胞中ORF2的量增加，尤其是细胞中ORF2多聚体的量增加。
10.权利要求1-9的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中HEV病毒的 复制和/或HEV病毒产量增加。
11.权利要求1-9的方法，其中相对于未用HDAC6抑制剂处理的细胞，细胞中VLP的组装 和/或VLP产量增加。
12.HDAC6抑制剂，如HDAC6抑制性核酸或HDAC6化学抑制剂，的用途，
(a)用于增加HEV ORF2的K411乙酰化水平,
(b)用于增加HEV ORF2的稳定性和/或ORF2产量，
(c)用于增加HEV病毒复制和/或病毒产量,或
(d)用于增加HEV VLP的组装和/或VLP产量的用途。
13.一种细胞培养系统，其包括：
(i)包含编码ORF2多肽的核酸的细胞；和(ii)HDAC6抑制剂，
其中所述抑制剂敲低细胞的HDAC6表达和/或降低HDAC6活性，
其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：
(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；
(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN且包含全长ORF2序列的 aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；
(c)(a)或(b)的同源物或变体。
14.权利要求13的细胞培养系统，其中所述抑制剂是引入所述细胞中的HDAC6抑制性核 酸分子，尤其是siRNA或shRNA或其表达构建体；或所述抑制剂是加入所述细胞的培养物中 的HDAC6化学抑制剂，尤其是HDAC6选择性抑制剂。
15.权利要求14的细胞培养系统，其中所述细胞是基因型1-4的HEV病毒感染的细胞。
16.权利要求14的细胞培养系统，其中所述细胞是引入了表达所述ORF2多肽的表达构 建体的重组细胞。
17.权利要求14-16的细胞培养系统用于生产病毒、病毒样颗粒或ORF2多肽的用途。
18.一种包含HDAC6敲低细胞的细胞培养物，其中所述细胞包含编码HEV ORF2的核酸，
其中所述ORF2多肽包含选自以下序列：
(a)基因型1-4，优选基因型1和4的HEV ORF2蛋白的全长序列；
(b)(a)的截短片段，所述片段包含肽序列E(P/L)TVK411LYTSVEN且包含全长ORF2序列的 aa125-601区域，尤其是由aa112-660氨基酸序列组成；
(c)(a)或(b)的同源物或变体，
优选地其中所述细胞是HEV感染的细胞，或是包含表达ORF2多肽的表达构建体的细胞。
19.权利要求17的细胞培养物用于生产HEV病毒、病毒样颗粒或ORF2多肽的用途。
20.根据权利要求1的方法得到的病毒、或根据权利要求2的方法得到的病毒样颗粒、或 根据权利要求3的方法得到的ORF2多肽用于制备免疫组合物或疫苗的用途。
21.一种治疗HEV病毒感染的方法，包括向感染HEV的个体施用HEV ORF2蛋白K411乙酰 化调节剂，其中所述调节剂降低ORF2蛋白K411的乙酰化水平，其中HEV病毒是基因型1-4的 HEV病毒。
22.权利要求21的方法，其中所述调节剂增加细胞中HDAC6的表达和/活性，优选地所述 调节剂是HDAC6表达核酸。
23.权利要求21的方法，其中所述个体是哺乳动物，例如人或猪。