发明名称：冠状病毒VLP（病毒样颗粒）及其制备方法及应用
摘要
本发明涉及病毒学领域，具体地，本发明涉及对SARS‑CoV‑2的N蛋白、M蛋白、E蛋白和/或部分ORF1ab基因组RNA进行改造，并基于所述改造提供了制备冠状病毒VLP的方法。此外，本发明还提供了基于所述方法制备的冠状病毒VLP，以及所述VLP的用途。
权利要求
1.一种冠状病毒病毒样颗粒(VLP)，其包含源自SARS-CoV-2的N蛋白的突变体，其中，与对应野生型N蛋白相比，所述N蛋白突变体包含选自以下的一个或多个突变：
(i)在对应于SEQ ID NO:1的第199位氨基酸残基的位置的残基(例如P残基)被置换为L残基；
(ii)在对应于SEQ ID NO:1的第202位氨基酸残基的位置的残基(例如S残基)被置换为R残基；
(iii)在对应于SEQ ID NO:1的第203位氨基酸残基的位置的残基(例如R残基)被置换为M残基；
优选地，所述N蛋白突变体包含突变(i)和(ii)，或者，所述N蛋白突变体包含突变(i)、(ii)和(iii)；
优选地，所述VLP不具备自主复制能力；
优选地，所述源自SARS-CoV-2的野生型N蛋白具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
优选地，所述N蛋白突变体具有选自SEQ ID NO:2-7任一项所示的氨基酸序列。
2.权利要求1的VLP，其进一步包含：包含包装信号序列的RNA分子；其中，所述包装信号序列选自源自SARS-CoV-2的PS9区或其截短体，其中，与所述PS9区相比，所述截短体在PS9区3’端截短了110-140个(例如，110-130个、110-126个、120-140个、126-140个、126-130个、120-130个、126个)核苷酸残基；
优选地，所述包装信号序列选自所述PS9区截短体；
优选地，与PS9区相比，所述截短体在PS9区3’端截短了126个核苷酸残基；
优选地，所述PS9区具有如SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；
优选地，所述PS9区的截短体具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
3.权利要求1或2的VLP，其进一步包含：M蛋白和E蛋白；其中，所述M蛋白和E蛋白选自源自SARS-CoV-2或SARS-CoV-1的M蛋白和E蛋白；
优选地，所述M蛋白和E蛋白选自源自SARS-CoV-1的M蛋白和E蛋白；
优选地，所述源自SARS-CoV-2的M蛋白具有如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；
优选地，所述源自SARS-CoV-2的E蛋白具有如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
优选地，所述源自SARS-CoV-1的M蛋白具有如SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列；
优选地，所述源自SARS-CoV-1的E蛋白具有如SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
4.权利要求1-3任一项的VLP，其进一步包含：S蛋白；其中，所述S蛋白选自源自冠状病毒的S蛋白；
优选地，所述冠状病毒选自人冠状病毒(例如，SARS-CoV-2、229E、NL63、SARS-CoV-1)、Sarbecovirus clade 1a(SARS-CoV-1样冠状病毒)和Sarbecovirus clade 1b(SARS-CoV-2样冠状病毒)；
优选地，所述冠状病毒选自SARS-CoV-2(例如，Omicron系列株)、229E、NL63、SARS-CoV-1、Sin852、GZ-C、Sino1-11、Urbani、HGZ8L1-A、GD01、PC4-127、PC4-13、PC4-137、GD03T0013、GZ0402、SZ1、LYRa11、WIV1、Rs7327、Rs4231、RsSHC014、Rs4084、RaTG13、Pangolin_GD(1/2019)、Pangolin_GX(P5L)；
优选地，所述SARS-CoV-2选自Wuhan Hu-1株，B.1株，B.1.1.7株，B.1.351株，P.1株，B.1.671.2株，BA.1株，BA.2株，BA.3株，BA.4/5株，BA.2.12.1株；
优选地，所述源自冠状病毒的S蛋白具有选自SEQ ID NO:14-45所示的氨基酸序列。
5.权利要求1-4任一项的VLP，其包含以下或由其组成：
(1)如权利要求1中定义的N蛋白突变体；
(2)如权利要求4中定义的S蛋白；
(3)如权利要求2中定义的包含PS9区截短体的RNA分子；
(4)如权利要求3中定义的源自SARS-CoV-1的M蛋白和E蛋白。
6.权利要求1-5任一项的VLP，其中，所述包含包装信号序列的RNA分子进一步包含报告蛋白的编码序列；优选地，所述报告蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白；
优选地，所述RNA分子进一步包含荧光素酶的编码序列；优选地，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。
7.分离的核酸分子，其包含编码N蛋白突变体的核苷酸序列，其中，所述N蛋白突变体如权利要求1中所定义。
8.权利要求7的分离的核酸分子，其进一步包含：如权利要求4中定义的S蛋白的编码序列；如权利要求2中定义的包含包装信号序列的RNA分子的编码序列；和/或，如权利要求3中定义的M蛋白和E蛋白的编码序列；
优选地，所述分离的核酸分子包含：如权利要求1中定义的N蛋白突变体的编码序列；如权利要求4中定义的S蛋白的编码序列；如权利要求2中定义的包含PS9区截短体的RNA分子的编码序列；以及，如权利要求3中定义的源自SARS-CoV-1的M蛋白和E蛋白的编码序列。
9.载体，其包含权利要求7或8的分离的核酸分子。
10.一种载体系统，所述载体系统包含一个或多个载体，其中，所述一个或多个载体包含：
(1)N蛋白突变体的编码序列，所述N蛋白突变体如权利要求1中定义；
(2)S蛋白的编码序列，所述S蛋白如权利要求4中定义；
(3)包含包装信号序列的RNA分子的编码序列，所述RNA分子如权利要求2中定义；
(4)M蛋白和E蛋白的编码序列，所述M蛋白和E蛋白如权利要求3中定义；
优选地，(3)所述的序列为包含PS9区截短体的RNA分子的编码序列；
优选地，(4)所述的序列为源自SARS-CoV-1的M蛋白和E蛋白的编码序列。
11.权利要求10的载体系统，其中，(3)中所述序列位于第一载体，(1)、(2)和(4)中所述序列位于另外的一个或多个载体；
优选地，(3)中所述序列位于第一载体，(1)和(2)中所述序列分别位于第二载体和第三载体，(4)中所述M蛋白编码序列和所述E蛋白编码序列共同位于第四载体；
优选地，(4)中所述M蛋白编码序列和所述E蛋白编码序列之间通过IRES的编码序列相连；
优选地，所述IRES的编码序列如SEQ ID NO:47所示。
12.权利要求10-11任一项的载体系统，其中，所述包含包装信号序列的RNA分子进一步包含报告蛋白的编码序列；优选地，所述报告蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白；
优选地，所述RNA分子进一步包含荧光素酶的编码序列；优选地，所述荧光素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示。
13.宿主细胞，其包含权利要求10-12任一项的载体系统。
14.制备冠状病毒VLP的方法，其包括：在允许所述VLP表达的条件下，培养权利要求13的宿主细胞；和，回收所表达的VLP；
优选地，所述方法包括：将权利要求10-12任一项的载体系统引入宿主细胞并培养，回收所述宿主细胞的培养上清中的VLP。
15.权利要求10-12任一项的载体系统或权利要求13的宿主细胞用于制备冠状病毒VLP的用途。
16.权利要求1-6任一项的冠状病毒VLP用于筛选药物或检测抗体活性(例如，结合活性和/或中和活性)的用途；
优选地，所述药物为抑制冠状病毒感染的药物；
优选地，所述抗体为针对冠状病毒的抗体。
17.检测抗体中和活性的方法，其包括：
(1)将包含待测抗体的样品与权利要求1-6任一项的VLP接触；
(2)将步骤(1)的产物与细胞接触，所述细胞能够被冠状病毒感染；和，
(3)检测所述细胞的感染率，从而评价所述待测抗体的中和活性；
优选地，所述抗体为针对冠状病毒的抗体。
18.权利要求17的方法，其中，所述VLP包含报告蛋白的编码序列；
优选地，步骤(3)中，通过所述报告蛋白在所述细胞中的表达检测所述细胞的感染率；
优选地，所述报告蛋白选自荧光素酶、荧光蛋白。
19.权利要求17或18的方法，其具备选自以下的一项或多项：
(a)所述细胞为表达ACE2和Furin的细胞；优选地，所述细胞为表达ACE2和Furin的293T细胞；
(b)步骤(2)中，所述步骤(1)的产物与细胞接触的时间为15-22h(例如，15-20h、15-18h、18-22h、18-20h、18h)；
(c)步骤(1)中，所述VLP的接种量为512-65610TCID50。