发明名称：一种EV71疫苗的体内效力评价方法及抗病毒药物筛选方法
摘要
本发明涉及一种EV71疫苗的体内效力评价方法及抗病毒药物筛选方法，具体涉及生物领域。更具体地，本发明建立了一个由动物模型、假病毒以及活体成像组成的敏感、安全、方便的EV71疫苗效力体内评价体系，为已有疫苗的质量控制和评价、新型疫苗的研制提供了新的方法；该方法还可以用于筛选EV71相关的抗病毒药物。
权利要求
1.一种构建肠道病毒EV71型感染模型的方法，其包括以下步骤：
1)向鼠科动物(优选大、小鼠)中定点插入人hSCARB2基因，获得基因敲入动物；
2)将1)中获得的基因敲入动物与对应的工具动物交配，启动hSCARB2基因表达，获得在 特定组织内特异表达hSCARB2基因的基因敲入动物；以及
3)任选地获得2)中的基因敲入动物的后代动物。
2.权利要求1的方法，其中所述步骤1)包括：
(1)利用胚胎干细胞敲入hSCARB2基因
通过分子载体构建技术获得能够与基因组内基因位点发生同源重组的打靶载体(例如 具有突变的目的基因、同源臂和抗性基因等)；例如利用电转染技术将打靶载体导入胚胎干 细胞，挑取抗药性胚胎干细胞，PCR(引物例如见表1)和Southern印迹筛选出正确打靶的胚 胎干细胞克隆；以及
(2)胚胎干细胞囊胚显微注射和种系遗传
选取其中的阳性胚胎干细胞克隆，并利用显微操作仪将其注入鼠科动物囊胚，从而形 成由野生型细胞和基因敲入的胚胎干细胞共同组成的嵌合体动物，胚胎干细胞在分化过程 中能够进入生殖系，形成嵌合体动物的生殖细胞，再经过交配把改造后的基因遗传给子代， 获得基因敲入动物。
3.权利要求1或2的方法，其中鼠科动物选自小鼠或大鼠和豚鼠，优选地，小鼠选自 C57BL/6、BALB/c、ICR和KM小鼠，最优选地，小鼠为C57BL/6小鼠。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中定点插入为将hSCARB2基因插入到Rosa26基因。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中工具动物为包含Cre重组酶的工具动物。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中鼠科动物为小鼠时，工具动物为Cre工具鼠。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤1)中利用构建体向鼠科动物中定点插入人 hSCARB2基因。
8.权利要求7的方法，其中所述构建体为通过hSCARB2基因的cDNA而改造的打靶载体。
9.权利要求8的方法，其中所述打靶载体包含启动子、终止信号以及加强mRNA转录稳定 性的元件。
10.权利要求9的方法，其中所述打靶载体为Ai3载体，其依次包含一个强CAG启动子，一 个两侧有loxP的终止信号，以及一个加强mRNA转录稳定性的WPRE元件。
11.权利要求7-10中任一项的方法，其中所述构建体中，hSCARB2基因的后面插入 tdTomato报告基因。
12.权利要求11的方法，其中所述报告基因所编码的酶与hSCARB2例如通过2A短肽有效 连接。
13.权利要求1-12中任一项的方法，其中所述方法还包括鉴定基因敲入动物的基因型 和表型。
14.权利要求13所述的方法，其中通过PCR、Sourthern印迹等方式鉴定基因敲入动物的 基因型，和/或通过real-time RT PCR、Western印迹和免疫荧光等方式鉴定目的基因的表 达以及分布。
15.权利要求14所述的方法，其中所述目的基因为hSCARB2基因。
16.利用动物模型评价EV71的抗体或疫苗的保护效力的方法，包括以下步骤：
1)获得权利要求1至15中任一项所述的动物模型；
2)用带有荧光报告基因的EV71假毒株感染1)中所获得的动物模型；
3)通过活体或解剖后组织的荧光成像观察和统计病毒量计算假病毒的AID50；
4)将待评价的EV71疫苗或EV71抗体注射入1)中所获得的动物模 型，同时用佐剂注射 1)中所获得的动物模型作为对照；
5)用带有荧光报告基因的EV71假毒株感染4)中得到的动物模型和对照；
6)通过活体或解剖后组织的荧光成像观察5)中的动物模型以及对照动物模型中的 EV71假病毒的分布；
7)用EV71疫苗或EV71抗体注射的动物模型中的EV71假病毒感染低于用佐剂注射的对 照动物模型中的EV71假病毒感染表明EV71疫苗或EV71抗体有效。
17.权利要求16所述的方法，其中荧光报告基因为Fluc基因，EGFP基因以及其它可能的 荧光报告基因。
18.权利要求16所述的方法，其中带有荧光报告基因的EV71假毒株为带有荧光报告基 因的EV71或者其它亚型的假病毒。
19.权利要求16所述的方法，其中带有荧光报告基因的EV71假毒株为带有Fluc基因的 EV71阜阳株假病毒(pEV71(FY)-Fluc)。
20.权利要求16-19中任一项的方法，其中步骤2)和5)中的感染包括以尾静脉注射、腹 腔注射、皮下注射、灌胃，以及呼吸道等方式感染。
21.权利要求20所述的方法，其中步骤2)和5)中的感染以尾静脉注射的方式进行。
22.权利要求16-21中任一项所述的方法，其中在EV71假病毒病毒为带有Fluc基因的 EV71阜阳株假病毒(pEV71(FY)-Fluc)且动物模型为小鼠时，AID50为1.58×107拷贝/小鼠。
23.权利要求16-21中任一项所述的方法，其中注射入动物模型的待评价的EV71疫苗的 量为50U-200U。
24.权利要求16-21中任一项所述的方法，其中注射动物模型的待评价的EV71抗体的量 为3U/ml-1000U/ml。
25.权利要求16-24中任一项所述的方法，其中被感染的动物模型为4周龄权利要求1至 15中任一项所述的小鼠模型。
26.权利要求16-25中任一项所述的方法，其中的感染剂量至少为 10AID50-200AID50。
27.权利要求26所述的方法，其中步骤5)中的感染计量为50AID50。
28.权利要求16-27中任一项的方法，其中EV71抗体为EV71抗血清。
29.权利要求16-28中任一项的方法，其中EV71疫苗为福尔马林灭活EV71疫苗。
30.权利要求29的方法，其中EV71疫苗为可购自Beijing Vigoo Biological Co.,Ltd 的EV71疫苗。
31.权利要求1-15中任一项所述的动物模型用于评价EV71疫苗的功效的用途。
32.权利要求31的用途，其中所述评价包括权利要求16-30中任一项所述的方法。