发明名称：人DPP4基因敲入的小鼠模型、其产生方法和用途

1.构建人二肽基肽酶4(hDPP4)基因敲入的新型小鼠模型的方法，所述方法包括：(a)在 保留小鼠基因组中二肽基肽酶4(mDPP4)基因的情况下，向小鼠基因组中的安全港基因座 (例如，Rosa26基因座、Hipp11基因座)处定点插入hDPP4基因；(b)获得在安全港基因座(例 如，Rosa26基因座、Hipp11基因座)处hDPP4基因纯合的小鼠；和(c)任选地，获得(b)中在安 全港基因座(例如，Rosa26基因座、Hipp11基因座)处hDPP4基因纯合的小鼠的后代；优选地， 所述小鼠选自C57BL/6、BALB/c、ICR和KM小鼠；优选地，所述定点插入是通过使用在安全港 基因座(例如，Rosa26基因座、Hipp11基因座)处产生双链断裂的核酸酶试剂产生的，优选 地，所述核酸酶试剂是转录激活子样效应子核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或CRISPR/ Cas系统(例如，CRISPR/Cas9系统)。

2.权利要求1所述的方法，其中所述步骤(a)包括：

(i)向小鼠的合子中引入CRISPR/Cas系统(例如，CRISPR/Cas9系统)和供体DNA，其中所 述CRISPR/Cas系统(例如，CRISPR/Cas9系统)能够在所述小鼠基因组Rosa26基因座的靶位 点处引入双链断裂，所述供体DNA包含hDPP4基因；

(ii)将获自(i)的各合子分别导入代孕鼠中妊娠，由代孕鼠产下后代；

其中所述合子、代孕鼠可以来自任何小鼠品系，例如，所述合子来自C57BL/6小鼠、 BALB/C小鼠、ABI小鼠等，代孕鼠来自KM小鼠、ICR小鼠等；

(iii)将代孕鼠产下的后代中经鉴定为hDPP4阳性的小鼠作为首建鼠，并将首建鼠(例 如，雌性首建鼠)与合子的来源背景鼠品系交配繁育，获得F1子代；

(iv)将F1子代阳性小鼠互交繁育，获得在Rosa26基因座处hDPP4基因纯合的小鼠。

3.权利要求2所述的方法，其中向小鼠的合子中引入的CRISPR/Cas系统(例如，CRISPR/ Cas9系统)是Cas mRNA(例如，Cas9mRNA)和向导RNA；Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)和向导 RNA；或者包含Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)编码基因的表达盒的和/或向导RNA的表达盒 的DNA构建体，优选地，所述Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)编码基因有效地连接至编码核定 位信号的一种或多种多核苷酸；

向小鼠的合子中引入的供体DNA是包含hDPP4基因的表达盒；优选地，向小鼠的合子中 引入的供体DNA是包含hDPP4基因的打靶载体；更优选地，所述打靶载体包含5’同源臂、剪接 受体(SA)、hDPP4基因、增强mRNA稳定性和翻译效率的元件(例如，土拨鼠肝炎病毒转录后调 节元件(WPRE))、多聚A序列、3’同源臂；最优选地，所述打靶载体包含5’同源臂、剪接受体 (SA)、hDPP4基因、内部核糖体进入位点(IRES)序列和/或2A序列、报告基因(例如，tdTomato 报告基因)、土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)、多聚A序列、3’同源臂；其中所述同源 臂是与该Rosa26基因座中的基因组序列同源的序列。

4.权利要求1-3中任一项所述的方法，其还包括鉴定在安全港基因座(例如，Rosa26基 因座)处hDPP4基因纯合的小鼠(例如，R26-hDPP4小鼠)的基因型和表型，所述在安全港基因 座(例如，Rosa26基因座)处hDPP4基因纯合的小鼠也称为基因敲入小鼠，优选地，通过PCR、 Sourthern印迹等方式鉴定所述基因敲入小鼠的基因型，通过逆转录聚合酶链反应(RT- PCR)鉴定所述基因敲入小鼠中hDPP4mRNA的表达，和/或通过Western印迹和生物发光成像 (BLI)等方式鉴定hDPP4蛋白的表达以及分布。

5.通过权利要求1－4中任一项所述的方法构建的hDPP4基因敲入小鼠模型的用途，用 于在BSL-3设施中使用MERS-CoV真病毒感染所述hDPP4基因敲入小鼠并评估抗MERS-CoV的 抗病毒剂和疫苗的体内功效，例如，评估抗MERS-CoV的抗病毒剂和疫苗的体内预防性和/或 治疗性功效，包括通过评估hDPP4基因敲入小鼠的体重、病毒载量、组织病理学评分、和/或 通过免疫组织化学分析来确定抗病毒剂和疫苗的体内功效。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述MERS-CoV真病毒感染是通过鼻内、腹膜内或胸 内等途径感染hDPP4基因敲入小鼠实施的。

7.通过权利要求1－4中任一项所述的方法构建的hDPP4基因敲入小鼠模型的用途，用 于在缺乏BSL-3设施的生物实验室(例如，在BSL-2设施)中使用假型MERS-CoV病毒感染所述 hDPP4基因敲入小鼠并评估抗病毒剂和疫苗的体内功效，例如，评估抗病毒剂和疫苗的体内 预防性和/或治疗性功效，包括通过评估hDPP4基因敲入小鼠的假型MERS-CoV病毒载量、通 过Q-PCR、BLI检测、组织病理学评分、和/或通过免疫组织化学分析来确定抗病毒剂和疫苗 的体内功效，优选地，使用所述假型MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠模型评估的抗病毒剂 和疫苗的效果与使用真MERS-CoV病毒感染R26-hDPP4小鼠模型评估的抗病毒剂和疫苗的效 果具有相关性。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述假型MERS-CoV病毒感染是通过将所述假型 MERS-CoV病毒以腹膜内途径感染或胸内途径感染hDPP4基因敲入小鼠实施的，优选地，以胸 内途径感染hDPP4基因敲入小鼠。

9.根据权利要求7或8所述的用途，其中所述假型MERS-CoV病毒是通过用包膜基因缺失 的HIV骨架质粒和含有MERS-Spike蛋白基因的表达质粒共转染哺乳动物细胞(例如，HEK293 细胞、HEK 293T细胞、HEK293FT细胞)并收获细胞培养上清而获得的，优选地，其中所述含有 MERS-Spike蛋白基因的表达质粒包含荧光报告基因，例如，Fluc基因、EGFP基因以及其它可 能的荧光报告基因。

10.切割作为靶DNA的小鼠Rosa26基因座处DNA的组合物，其包含特异于靶DNA的单一向 导RNA或编码单一向导RNA的DNA、和Cas蛋白质编码核酸或Cas蛋白质的组合物；例如，包含 单一向导RNA和Cas mRNA(例如，Cas9mRNA)；或者包含单一向导RNA和Cas蛋白质(例如，Cas9 蛋白质)；或者包含单一向导RNA的表达盒和/或Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)编码基因的 表达盒的DNA构建体，其中所述Cas蛋白质(例如，Cas9蛋白质)编码基因有效连接至编码核 定位信号的一种或多种多核苷酸；优选地，所述单一向导RNA包含SEQ ID NO:2所示的核苷 酸序列TAGGCCGCACCCTTCTCCGG和/或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列 AAACCCGGAGAAGGGTGCGG，所述Cas蛋白质是衍生自链球菌属物种(Streptococcus sp.)，优 选化脓性链球菌(Streptococcus pyogens)的Cas蛋白质，例如，所述Cas蛋白质包含SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少50％同源性的 氨基酸序列，优选地与SEQ ID NO：6具有至少60、70、80、90、95、97、98、或99％同源性的氨基 酸序列。