发明名称：一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法
摘要
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法。本发明构建了包含EGFP和RFP不同荧光蛋白报告基因的HPV假病毒，建立了包含不同报告基因假病毒混合检测不同中和抗体的检测方法。该方法操作简便、检测周期短(72小时)、灵敏度高、可重复性好、结果判读客观、高通量、样品需求量少、检测成本低、方法可标准化，便于实验室间推广、可同时检测针对多种型别病毒的中和抗体，更接近疫苗免疫后的真实状况。
权利要求
1.一种人乳头瘤病毒中和抗体的高通量检测方法，其特征在于，包括如 下步骤：
步骤1：获得结构基因表达质粒p16LLw和p18LLw；
步骤2：将步骤1所述结构基因表达质粒p16LLw和结构基因表达质粒 p18LLw与荧光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP、荧光蛋白报告质粒pRwB共转 染真核表达细胞，获得假病毒；
步骤3：将待测样本和步骤2获得的假病毒分别稀释，混合，假病毒感染 真核细胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得检测样本斑点数；
步骤4：和步骤2获得的假病毒稀释后与培养基混合，假病毒感染真核细 胞，表达荧光蛋白，经荧光斑点计数，获得病毒对照斑点数；
步骤5：将培养基加入真核细胞，经荧光斑点计数，获得细胞对照斑点数；
步骤6：获得感染抑制率(％)＝[1-(检测样本斑点数-细胞对照斑点数) /(病毒对照斑点数-细胞对照斑点数)]×100；
步骤7：以所述待测样本的稀释度作为X，以所述感染抑制率作为Y，用 Reed-Muench法获得所述待测样本的中和滴度IC50；
步骤8：所述待测样本的中和滴度IC50＞40时，为HPV型特异性中和抗 体阳性。
2.根据权利要求1所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2所述真 核表达细胞为293FT细胞。
3.根据权利要求1或2所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤2所 述共转染真核表达细胞具体为：
步骤(1)：胰酶消化293FT细胞，于37℃，5％CO2的条件下培养；
步骤(2)：利用Lipofectamine2000将结构基因表达质粒p16LLw和p18LLw 分别与荧光蛋白报告质粒PCDNA3-GFP和pRwB共转染293FT细胞。
4.根据权利要求3所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤(2)具体 为：
步骤①：待细胞汇合率达50％时，取所述结构基因表达质粒和所述荧光蛋 白报告质粒各15μg溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培养基中，混匀；
步骤②：取75μl Lipofectamine2000，溶于1.875ml无抗性、无牛血清的培 养基中，混匀，室温静置5min，获得Lipofectamine2000混合液；此步骤不超过 25min；
步骤③：将所述Lipofectamine2000混合液加入质粒混合液中，轻柔混匀， 室温孵育20min；
步骤④：将步骤③获得的孵育好的混合液与步骤1培养获得的293FT细胞 混匀；
步骤⑤：于37℃、5％CO2的条件下，孵育6小时后，换液；
步骤⑥：转染48小时后收集细胞。
5.根据权利要求4所述的高通量检测方法，其特征在于，步骤⑥具体为：
步骤(A)：转染后48小时，弃去细胞的培养基上清；
步骤(B)：用胰酶消化步骤(A)获得的细胞，完全培养基终止，收集 细胞悬液；
步骤(C)：离心210×g，5min，弃上清；
步骤(D)：用1ml DPBS-Mg将细胞重悬，将细胞悬液离心，弃上清。
6.根据权利要求3至5任一项所述的高通量检测方法，其特征在于，步 骤(1)具体为：胰酶消化293FT细胞，计数，将6×106个细胞/15ml接种于 75cm2细胞培养瓶中，于37℃，5％CO2的条件下培养。
7.根据权利要求1至5任一项所述的高通量检测方法，其特征在于，步 骤2所述获得假病毒包括细胞裂解、盐抽提、假病毒的滴定。
8.根据权利要求7所述的高通量检测方法，其特征在于，细胞裂解具体 为向共转染后的真核表达细胞加入与等体积的细胞裂解液，混匀，37℃孵育 24小时；所述细胞裂解液为：1/20体积的10％Triton X-100(Pierce#28314) (终浓度为0.5％)，0.1％的Benzonase.0.1％的Plasmid Safe，1/40体积1mol/L 的硫酸铵(pH 9)；
所述盐抽提具体为：
步骤(1)：弃去所述细胞裂解液，冰浴5min；
步骤(2)：加入细胞0.17倍体积的5M的NaCl溶液，使盐浓度调整为 850mmol/L；
步骤(3)：冰浴10～20min；
步骤(4)：离心5000×g，10min；
步骤(5)：取上清，分装、-70℃冻存。
9.根据权利要求7或8所述的高通量检测方法，其特征在于，所述假病 毒的滴定具体为：
步骤(1)：预先6小时铺293FT细胞于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为 1.5×104个/100μl，于37℃，5％CO2的条件下培养；
步骤(2)：将所述假病毒进行起始稀释度为1000倍的倍比稀释，获得假 病毒稀释液；
步骤(3)：在所述96孔细胞培养板中，每孔加入100μl假病毒稀释液；
步骤(4)：置于37℃，5％CO2的条件下培养72小时；
步骤(5)：用Florospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数；
步骤(6)：用Reed－Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量 (TCID50)，即病毒感染一半组织细胞时的病毒稀释度；
所述用Reed－Muench方法计算获得组织细胞培养半数感染量(TCID50) 具体为：
步骤①：计算各病毒稀释度阳性孔数目(a)和阴性孔数目(b)；
步骤②：计算阳性和阴性孔的累积数：阳性孔累积数由下向上累计(c)， 阴性孔累积数由上向下累计(d)；
步骤③：计算阳性孔的百分比：比率＝(c)/〔(c)+(d)〕×100；
步骤④：计算距离比例：距离比例＝(大于50％的阳性百分比－50)/(大 数于50％的阳性百分比－小于50％的阳性百分比)；
步骤⑤：TCID50的对数＝大于50％的阳性百分比的最高稀释倍数的对数+ 距离比例×稀释系数的对数。
10.根据权利要求1至9任一项所述的高通量检测方法，其特征在于， 步骤3具体为：
步骤(1)：预先6小时铺293FT细胞于96孔板，每孔细胞数为1.5×104个 /100μl，于37℃，5％CO2的条件下培养；
步骤(2)：将假病毒按照固定的假病毒接种量(200TCID50/孔)进行稀 释，将包含绿色荧光蛋白的HPV16和包含红色荧光蛋白的HPV18的两种假病 毒等量混合，终体积为60μl的假病毒稀释液；
步骤(3)：将待测样本做初始稀释度为1:40的4倍倍比稀释，获得待测样 本稀释液；
步骤(4)：在96孔板中，将所述假病毒稀释液和所述待测样本稀释液等 体积混合(60μl+60μl)，每份样品作双复孔；
步骤(5)：于4℃放置1小时；
步骤(6)：从各孔中吸取100μl的假病毒血清混合物贴壁缓缓加入预先已 铺好细胞的培养板对应孔中，混匀；
步骤(7)：置于37℃，5％CO2的条件下培养72小时；
步骤(8)：用Fluorospot荧光斑点计数仪扫描计数每孔荧光斑点数。