发明名称：一种改造的高滴度SARS-CoV-2假病毒
摘要
本发明涉及Spike蛋白的突变体，包含所述突变体的融合蛋白和类病毒颗粒。所述类病毒颗粒可用于抗SARS‑CoV‑2的抗体和药物的筛选(例如，检测SARS‑CoV‑2抗体的中和活性，或者在细胞水平上筛选抑制SARS‑CoV‑2感染的药物)。本发明还涉及包含上述蛋白的制备方法。本申请的假病毒的研制，使得SARS‑CoV‑2的研究不局限于高等生物安全条件的实验室。并且，所述假病毒应用广泛。例如，能够应用于抗体中和能力的检测中。
权利要求
1.Spike蛋白的突变体，与野生的新型冠状病毒的Spike蛋白相比，其在对应于野生的新型冠状病毒的Spike蛋白的下述至少2个(例如，2个，3个，4个)氨基酸位点上包含突变：第417位的位点，第613位的位点，第614位的位点和第709位的位点；
优选地，所述野生的新型冠状病毒的Spike蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
优选地，所述Spike蛋白的突变体具有选自下列的任意一项或多项：
(1)在对应于SEQ ID NO：1的第417位的位点上的氨基酸被突变为天冬氨酸；
(2)在对应于SEQ ID NO：1的第613位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸；
(3)在对应于SEQ ID NO：1的第614位的位点上的氨基酸被突变为甘氨酸；
(4)在对应于SEQ ID NO：1的第709位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸。
2.权利要求1所述的Spike蛋白的突变体，所述Spike蛋白的突变体还在C端截短了13-23个(例如，13个，14个，15个，16个，17个，18个，19个，20个，21个，22个，23个)氨基酸；
优选地，所述Spike蛋白的突变体还在C端截短了21个氨基酸；
任选地，与野生的新型冠状病毒的Spike蛋白相比，所述Spike蛋白的突变体还含有缺失，即，在下述位置上的氨基酸被缺失：与SEQ ID NO:1的第669-672位对应的位置；
优选地，所述被缺失的氨基酸为furin酶切位点；
优选地，所述被缺失的氨基酸为PRRA。
3.权利要求1或2所述的Spike蛋白的突变体，其具有选自下列的任意一项或多项：
(1)所述Spike蛋白的突变体在对应于SEQ ID NO：1的第613位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸，且在对应于SEQ ID NO：1的第614位的位点上的氨基酸被突变为甘氨酸；
(2)所述Spike蛋白的突变体在对应于SEQ ID NO：1的第614位的位点上的氨基酸被突变为甘氨酸，且在对应于SEQ ID NO：1的第709位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸；
(3)所述Spike蛋白的突变体在对应于SEQ ID NO：1的第417位的位点上的氨基酸被突变为天冬氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第614位的位点上的氨基酸被突变为甘氨酸；且所述Spike蛋白的突变体还在C端截短了21个氨基酸；
(4)所述Spike蛋白的突变体在对应于SEQ ID NO：1的第417位的位点上的氨基酸被突变为天冬氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第613位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第614位的位点上的氨基酸被突变为甘氨酸，且在对应于SEQ ID NO：1的第709位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸；
(5)所述Spike蛋白的突变体在对应于SEQ ID NO：1的第417位的位点上的氨基酸被突变为天冬氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第613位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第614位的位点上的氨基酸被突变为甘氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第709位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸；且所述Spike蛋白的突变体还在C端截短了21个氨基酸；
(6)所述Spike蛋白的突变体在对应于SEQ ID NO：1的第417位的位点上的氨基酸被突变为天冬氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第613位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第614位的位点上的氨基酸被突变为甘氨酸，在对应于SEQ ID NO：1的第709位的位点上的氨基酸被突变为组氨酸；且所述Spike蛋白的突变体还在C端截短了21个氨基酸；与野生的新型冠状病毒的Spike蛋白相比，所述Spike蛋白的突变体还含有缺失，即，在下述位置上的氨基酸被缺失：与SEQ ID NO:1的第669-672位对应的位置；
(7)所述Spike蛋白的突变体具有如SEQ ID NO:5、6、7、10、11、12或13所示的氨基酸序列；
(8)与SEQ ID NO:5、6、7、10、11、12或13所示的序列相比具有一个或多个氨基酸的置换、缺失或添加(例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的置换、缺失或添加；例如1个，2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个或10个氨基酸的保守置换)的氨基酸序列；或
(9)与SEQ ID NO:5、6、7、10、11、12或13所示的序列相比，具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％的序列同一性的氨基酸序列。
4.融合蛋白，其包含权利要求1-3任一项所述的Spike蛋白的突变体以及另外的多肽；
优选地，所述另外的多肽任选地通过接头连接至所述蛋白的N端或C端；
优选地，所述另外的多肽选自增强子、标签、信号肽或导肽、可检测的标记(例如，荧光素酶(fluc)、绿色荧光蛋白(GFP))，或其任意组合；
优选地，所述另外的多肽为增强子，且所述增强子连接至所述Spike蛋白的突变体的N端；
优选地，所述增强子具有如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。
5.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1-3任一项所述的Spike蛋白的突变体，或者编码权利要求4的融合蛋白。
6.一种载体，其包含权利要求5所述的核酸分子；
优选地，所述载体选自质粒(例如，PCDNA3.1)，噬菌粒，柯斯质粒，人工染色体，噬菌体或病毒载体；
优选地，所述载体用于表达(例如在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达)所述Spike蛋白的突变体。
7.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的核酸分子或权利要求6所述的载体；
优选地，所述细胞为哺乳动物的细胞；
优选地，所述哺乳动物的细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；
优选地，所述细胞为表达或过表达人ACE2蛋白的细胞(例如，293T细胞)；
优选地，所述宿主细胞还包括包装质粒。
8.一种类病毒颗粒，所述类病毒颗粒含有权利要求1-3任一项所述的Spike蛋白的突变体或含有权利要求4的融合蛋白；或者，所述类病毒颗粒由权利要求1-3任一项所述的Spike蛋白的突变体或权利要求4的融合蛋白组成；
优选地，所述类病毒颗粒还含有核酸组分；
优选地，所述核酸组分为包装质粒；
优选地，所述核酸组分获自VSV病毒基因组。
9.一种类病毒颗粒的制备方法，所述方法包括将权利要求6所述的载体和包装质粒转入宿主细胞中；
优选地，将权利要求6所述的载体和包装质粒通过瞬时转染或稳定转染至宿主细胞中；
优选地，所述宿主细胞为人的细胞，例如，造血细胞，上皮细胞，肝细胞，肿瘤细胞，神经细胞；
优选地，所述类病毒颗粒感染的细胞为过表达人ACE2蛋白的细胞(例如，293T-ACE2)。
10.一种检测SARS-CoV-2抗体中和活性的方法，所述方法包括，在将权利要求8所述的类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒与所述抗体或宿主细胞接触。
11.一种筛选能够抑制SARS-CoV-2感染细胞的候选药物的方法，所述方法包括，在将权利要求8所述的类病毒颗粒与宿主细胞接触之前、同时或之后，将所述类病毒颗粒或宿主细胞与所述候选药物接触。
12.权利要求1-3任一项所述的Spike蛋白的突变体、权利要求4所述的融合蛋白、权利要求5所述的分离的核酸分子、权利要求6所述的载体、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8所述的类病毒颗粒用于检测或筛选抗SARS-CoV-2抗体或药物的用途。